Terapia genética: Nova perspectiva no avanço à cura da infecção pelo HIV- Juliana Oliveira Bitante e Otávio Rodrigues Filho

Após mais de 30 anos, a AIDS continua sendo um dos maiores desafios mundiais à saúde, tendo causado mais de 35 milhões de mortes em todo o mundo. Globalmente, a infecção por HIV aparece como a quinta principal causa de morte entre adultos e a principal causa de morte de mulheres entre 15 e 49 anos. Embora a doença ainda não tenha a cura estabelecida pelo atual arsenal terapêutico e conhecimento científico, avanços têm sido observados, o que permite vislumbrar, em um futuro próximo, um mundo sem AIDS.^(1,2)

O receptor celular primário para a entrada do HIV nas células humanas é o receptor CD4. No entanto, somente a expressão do CD4 não é suficiente para a infecção pelo vírus. Vários co-receptores de quimiocinas atuam para permitir a entrada do HIV, quando co-expressos com CD4 na superfície de uma célula. CXCR4 e CCR5 foram identificadas como os principais co-receptores humanos para a entrada do vírus HIV-1 em células alvo. Especificamente, o CXCR4 é usado pelo vírus em linhagens de células T (X4), o CCR5 em linhagens de macrófagos (R5).^(3,4,6) Outro co-receptor, chamado CCR3, também foi descrito como co-receptor para alguns tipos isolados de HIV-1 e HIV-2.⁽⁵⁾

 

CXCR4 foi o primeiro destes a ser identificado. A co-expressão de CXCR4 e CD4 nas células T permite ao HIV se fundir e infectar   gp120 (glicoproteína estrutural do vírus) interage com CD4 e CXCR4 para aderir à célula e efetuar alterações conformacionais no complexo gp120/gp41, permitindo a fusão da membrana celular pela gp41(glicoproteína viral do HIV).⁽⁶⁾ Depois, outro co-receptor foi identificado como CCR5, este é expresso em macrófagos e em algumas populações de células T e pode também atuar em conjunto com CD4 para permitir a fusão da membrana celular com o HIV.⁽⁷⁾

 

O CCR5 e CXCR4 são considerados os dois principais co-receptores para a entrada do HIV nas células, no entanto, outros co-receptores já foram identificados, CCR3 por exemplo, uma quimiocina expressa em eosinófilos e células da microglia, é usado por algumas cepas de HIV para a infecção da microglia. É possível que outros receptores possam também ligar-se a gp120 do HIV e ser utilizado para entrada nas células do hospedeiro.⁽⁸⁾

 

Lavi et. al, determinaram em seu estudo a expressão de CXCR4 em cultura de células cerebrais humanas, um alvo importante da patologia do HIV, usando a reação com anticorpos específicos para CXCR4. Eles relataram a expressão de CXCR4 em vários tipos de células cerebrais, especialmente em neurônios e microglia.^(9). Albright et al, afirmaram que a micróglia é o reservatório principal de HIV no sistema nervoso central. Em seu estudo, caracterizaram os receptores de quimiocinas encontrados em células microgliais humanas, analisaram a expressão de CCR5, CCR3 e CXCR4 e seus papéis na entrada do HIV nestas células cultivadas. Nas suas conclusões, descreveram que as células microgliais expressaram níveis mais elevados de CCR5 do que CCR3 ou CXCR4, e concluíram que o co-receptor CCR5 é predominante utilizado para a infecção de microglia humana pelo HIV-1.⁽¹⁰⁾

 

Até hoje, apesar dos avanços em pesquisas, a única alternativa dos pacientes em tratamento é o uso do “coquetel medicamentoso” para controle da infecção. Graças ao desenvolvimento e aplicação do HAART (highly active antiretroviral therapy) em meados dos anos 90, os pacientes infectados pelo HIV tiveram uma melhora significativa em sua qualidade de vida e longevidade.⁽¹¹⁾ Recentemente, as classes de drogas disponíveis, assim como sua potência e tolerância pelo organismo, possibilitaram à maioria dos pacientes alcançarem a supressão dos seus níveis virais sanguíneos abaixo do limite de detecção estabelecido de 50 cópias por ml de sangue.⁽¹²⁾  Entretanto, há a persistência da infecção em “reservas” no organismo, que logo retorna a altos níveis quando a terapia é interrompida, reiniciando a progressão da doença.^(13,14)

 

 

Os santuários anatômicos virais garantem ao HIV uma possibilidade de fuga da terapia farmacológica usual, já que os níveis alcançados pelo HAART nestes tecidos são consideravelmente baixos, principalmente no cérebro e nódulos linfáticos. Possivelmente, nestes locais a replicação viral continua diferente do que ocorre no sangue.⁽¹⁵⁾ O vírus latente escapa dos medicamentos antivirais e do sistema imune por se integrar ao genoma do hospedeiro, iniciando uma transcrição silenciosa, driblando o reconhecimento das defesas próprias e não avançando para os estágios de ciclo viral que são atingidos pelo HAART.⁽¹⁶⁾  Os astrócitos, por exemplo, são considerados como “reservas de HIV” por abrigarem o vírus em baixa replicação, contudo podendo transferir a infecção para outros tipos de células. Outra característica para a formação destes santuários está baseada no fato das drogas antivirais atuais não conseguirem cruzar a barreira hematoencefálica.^(17). Desta forma, o HAART mantém a doença, até certo ponto, sob controle, todavia não é o bastante para a cura.

 

 

Várias linhas de pesquisa estão em desenvolvimento pelo mundo em busca da tão sonhada cura da AIDS, entre elas: remoção dos vírus das reservas anatômicas; inibição da expressão de PD-1 (programmed cell death protein 1); terapias de vacinação; imunoterapias; terapias genéticas para remoção do DNA proviral das células infectadas, eliminação de células que expressem proteínas do HIV, criação de células resistentes à infecção pelo HIV, supressão da expressão de receptores celulares, dentre outras.⁽¹⁶⁾

 

A terapia genética envolve manipulação do DNA ou RNA para tratamento e prevenção de doenças humanas. As estratégias são diversas e incluem: retificação, relocação ou deleção de genes específicos em casos de doenças. Esta é a promissora base de estudos para tratamento de desordens como: câncer, doenças hematológicas, diabetes, doenças coronarianas, doenças neurodegenerativas, AIDS, entre outras.⁽¹⁸⁾

 

A alteração genômica é o processo de alteração de um sítio genético específico para interromper ou alterar sua função normal. A estratégia de prevenção do HIV por alteração dos receptores celulares que facilitam sua penetração nas células do hospedeiro tem se demonstrado promissora. Esta estratégia visa prevenir a depleção de células T CD4+, prevenindo o desenvolvimento da AIDS. Eventualmente, sem novos eventos de infecção, as reservas virais existentes em atividade ou as células infectadas em latência poderiam diminuir ou até desaparecer.⁽¹⁹⁾

 

Estudos demonstram o uso da terapia genética para infecção por HIV, agindo no genoma viral ou por indução de proteção do hospedeiro com mutações terapêuticas nas células humanas. Como já citado, o estabelecimento de reservas do HIV requerer a integração do DNA do vírus no genoma celular do hospedeiro, eventos epigenéticos. Então, teoricamente, deletar ou desativar o DNA proviral poderia eliminar as reservas virais latentes e ser uma ferramenta de cura da AIDS. Algumas possibilidades já vêm sendo exploradas neste contexto: uso de ZNFs (Zinc-finger-nucleases), capazes de recombinar e clivar sequências específicas de DNA viral e o novo sistema CRISPR-Cas9, por exemplo.

 

Vírus HIV isolados parecem utilizar o CCR5 como co-receptor para a infecção tanto de macrófagos quanto de algumas células T. Indivíduos com mutações em determinados sítios deste co-receptor são resistentes à infecção ^(20,21,22).  Ainda, a progressão da doença parece ter ligação com a quantidade de CCR5 existente, pois as complicações pela infecção parecem ser mais lentas nos indivíduos com alteração deste, o que evidencia o potencial da terapia antiviral pela prevenção da interação do vírus com o co-receptor. Além disso, a eliminação da chave para infecção celular minimizaria as chances de mutações virais para escape da terapia.⁽²³⁾

 

 

Estas descobertas impulsionaram as pesquisas. O marco no assunto foi o estudo do “PACIENTE DE BERLIM” que se curou da infecção por HIV após ser submetido a dois transplantes de medula óssea para tratamento de leucemia, onde seu doador era homozigótico para uma mutação no receptor CCR5∆32. ^(24,25,26) A aparente cura deste paciente e a possibilidade de aplicação de um protocolo semelhante em larga escala, inspirou pesquisadores a buscarem uma geração de células resistentes ao HIV através da engenharia genética.

 

 

Teoricamente, o receptor celular ou co-receptores envolvidos na entrada de HIV-1 nas células podem ser utilizados como alvos para a inibição da infecção viral. No entanto, o receptor CD4 desempenha um importante papel no sistema imune do hospedeiro, o que torna a sua supressão inaceitável. Por outro lado, os indivíduos com mutações naturais no CCR5, co-receptor para HIV, não apresentam deficiências imunes ^(27,28).

 

A importância do CCR5 na transmissão do HIV e infecção em curso, bem como o impacto limitado sobre a saúde pela alteração do co-receptor, visto em indivíduos homozigotos do alelo D32, faz inibidores de CCR5 candidatos atraentes tanto para prevenção quanto para um possível tratamento^(29). Alterações pelos sistemas modernos de edição de genes do CCR5 são permanentes e hereditárias. Assim o tratamento poderia potencialmente tornar a célula permanentemente HIV-resistentesA eficácia de ruptura do gene é um dos critérios mais importantes para um instrumento de edição genética. As publicações disponíveis parecem promissoras. Por outro lado, os efeitos fora do alvo dos sistemas estão longe de serem claros.

 

ZFN e CRISPR/Cas9 são ferramentas versáteis para disrupção de genes que têm o potencial para revolucionar o campo da terapia gênica contra o HIV. Elas fornecem meios poderosos para interromper fatores necessários para a infecção pelo vírus, bem como para eliminar o genoma do HIV integrado ao hospedeiro sendo considerado um meio para erradicar a latência viral.^(30).

⁽²⁹⁾ Pesquisas mais atuais se voltam para o estudo de vetores que levariam os sistemas de edição até seu alvo celular.

ZNF (Zinc Finger Nucleases) são uma classe de fatores de transcrição eucarióticos que se ligam ao DNA e que atuam em conjunto com fatores específicos de restrição para clivagem de sítios deste DNA. Assim, cada módulo reconhece pares de bases restritas na fita genética da célula.⁽³¹⁾ Uma vez que cada par ZFN é projetado especificamente para reconhecer uma determinada sequencia de pares de bases, pode, teoricamente, ser projetado para torná-lo único e altamente específico para o gene alvo, levando à sua ruptura. Como resultado poderia estimular os mecanismos de reparo do DNA e alterar funções celulares, através de inserções de nucleotídeos, supressão ou mutação gênica^(29).

 

 

O primeiro relatório sobre alteração de CCR5 pela tecnologia ZFN foi publicado em 2005. Mani et al. demonstraram que ZFN foi capaz de clivar especificamente o gene do CCR5 celular utilizando um sistema in vitro de transcrição-tradução^(32). Baseado em sua capacidade efetiva e específica de modificação de genes, a tecnologia tem sido amplamente utilizada para a edição do genoma em vários tipos de células e organismos vivos tal como para o HIV-1, no qual a maioria das publicações se voltam para a modificação de co-receptores CCR5 ou CXCR4^(33,34,35). Entretanto, terapias visando atingir o genoma do HIV-1 também vêm sendo testadas como possível estratégia alternativa⁽³⁶⁾.

 

CRISPR é uma nova ferramenta de edição genética aplicável a células de mamíferos, denominado sistema CRISPR-Cas9 (Clustered regularly interspace short palindromic repeats–associated nuclease 9), que se baseia na modificação do sistema CRISPR natural de Streptococcus pyogenes tipo II em crRNA fundidos com tracrRNA trans-codificado. Este sistema é composto por um guia RNA e uma nuclease Cas9 humana, que formam um complexo RNA-proteína para clivar sequências-alvo originais correspondentes às do gRNA, e tem se tornado uma ferramenta promissora para várias aplicações médicas.⁽³⁷⁾

 

O sistema CRISPR-Cas9 utiliza um curto trecho de RNA complementar ligado a nuclease Cas9 para reconhecer e clivar o DNA alvo, ao contrário das tecnologias anteriores que utilizam proteínas ou moléculas efetoras de transcrição ligadas diretamente ao DNA. A ação em seu alvo é determinada pela combinação das proteínas na fita de DNA.^(12). As tecnologias mais recentes permitem interrupção permanente do gene alvo, após um único tratamento.⁽²⁹⁾ A edição genética em organismos de mamíferos usando esta ferramenta iniciou-se em 2013. Esta técnica oferece vantagens como: simplicidade de desenvolvimento e de uso e capacidade de edição de diversos genes simultaneamente. Consequentemente apresenta ótimo custo-benefício e é tida como proposta para edição de variados genomas em terapia genética, inclusive alteração da expressão de receptores celulares utilizados pelo HIV para adentrar as células humanas. O uso da terapia é estudado por seu potencial na participação na indução terapêutica ou mutação protetora em tecidos, por exemplo: a mutação nos receptores 5 de quimiocinas (CCR5) e CXCR4 ^(24,38).

 

O desenvolvimento desta tecnologia, capaz de utilizar uma fita da cadeia de RNA para recombinar e mutar alvos no DNA, também vem sendo testado como estratégia para inativar o DNA do HIV, recombinando sítios específicos do genoma, inserindo ou deletando genes.⁽³⁹⁾  CRISPR/Cas9 tem demonstrado grande potencial na inativação DNA viral, sendo capaz de se integrar em diferentes sítios do DNA celular, tanto nos casos de transcrição latente quanto em transcrição ativa de DNA do vírus com eficiência similar, sendo uma terapia eficiente na eliminação de reservas latentes de HIV-1.⁽⁴⁰⁾ Entretanto os estudos esbarram em alguns obstáculos como, por exemplo, o fato de que o sistema exige a concepção de uma guia de RNAs (gRNAs) idêntica ao local de excisão desejada.⁽⁴¹⁾  Para reduzir possíveis efeitos fora do alvo, este ainda não pode ser homólogo ao genoma do hospedeiro, o que não é fácil devido à semelhança do HIV com muitos retrovírus infectantes de células humanas. A alta mutabilidade do HIV, juntamente com a variabilidade inter e intra-paciente é mais um problema. Além disso, a segmentação do LTR viral, ou fator de transcrição, envolve alvos que são semelhantes aos presentes em códigos genéticos humanos essenciais

Estudos:

 

Perez et al e Holt at al comprovaram que a ZNF pode inativar CCR5 em células humanas TCD4+ e em células embrionárias hematopoiéticas CD34+, limitando a replicação viral em ratos.^(42,43).

^(44,45) Resultados de estudos em fase inicial demonstram que pacientes tratados com células T CD4+ com CCR5 modificadas por ZNFs tiveram incremento substancial de células CD4+, e baixa na expressão de PD-1*. A viremia ficou controlada após a interrupção do tratamento de muitos pacientes, porém o cART foi retomado na maioria por infecção ou aumento dos níveis virais.

*PD-1: Moléculas imunorreguladoras de morte celular programada. Apontadas como um fator importante na exaustão imune de células T ⁽¹⁸⁾

^(46,47,48), na infecção pelo HIV. Dados que sugerem que a PD-1 também contribui para a manutenção da infecção latente por HIV em células T CD4 + de memória. Discute-se a manipulação da via PD-1 como uma estratégia terapêutica potencial para aumentar a resposta imune contra o HIV, melhorar a restauração imune geral, facilitar a erradicação viral ou desenvolver vacinas contra o HIV.

Henrich descreveu um estudo com dois pacientes HIV+ que receberam transplante de medula óssea de doador homozigótico para CCR5-32 teve como resultado a manutenção de níveis indetectáveis de HIV por 8 a 17 meses no sangue periférico (exames feitos por meio de PCR para DNA HIV). Mais investigações estão sendo feitas para determinar a duração da efetividade da terapia. A desvantagem é o óbvio risco do procedimento de quimioterapia e transplante medular.

Perez usou ZFN para manipular a expressão de CCR5 em células CD4+ e seus precursores. Demonstrou que a introdução de ZNF específica para CCR5 em culturas celulares de CD4+ resulta em proteção estável contra infecção do HIV que pode ser transmitida para as células filhas. Mais tarde, a introdução destas células em ratos com células infectadas por HIV demonstraram redução da taxa viral e aumento dos níveis de CD4+ quando comparado com grupo controle.⁽⁴⁹⁾

⁽⁵⁰⁾

⁽⁵¹⁾ Resultados similares foram constatados por Holt, quando células-tronco hematopoiéticas modificadas foram introduzidas em ratos.  Estas células foram introduzidas em ratos infectados por HIV resultando em redução viral e aumento dos níveis de células T CD4+ quando comparados com ratos do grupo controle.⁽⁵²⁾  Em outro estudo, células modificadas foram implantadas em ratos infectados por HIV e houve uma rápida seleção das células CCR5 modificadas, resultando em depleção viral e aumento dos níveis de células T CD4+ quando comparados aos ratos do grupo controle. ⁽⁵³⁾

 

Estudos clínicos em humanos em andamento também demonstram segurança e eficácia do tratamento de células autólogas tratadas com ZNFs modificando a expressão de receptores CCR5, com efeitos em contagem de células T CD4+, níveis virais e a habilidade destas células em localizar as reservas virais. Os resultados preliminares indicam que este tratamento é bem tolerado e capaz de aumentar os níveis de T CD4+.^(53,54)

 

Hua et al publicaram seu estudo com células mielóides, tipos de células primárias infectadas pelo VIH-1 no cérebro, utilizando terapia genética Cas9/gRNA aplicada para eliminar o genoma do HIV-1 integrado à célula hospedeira. Foram identificados alvos altamente específicos dentro da região U3 da LTR do HIV-1, que editados inativaram a expressão do gene viral e sua replicação em microglia infectada de forma latente e em células T. Não foram identificados genotoxicidade, edição offtarget nas células hospedeiras, e foi completamente excisado o fragmento de DNA proviral que estava integrado a célula. Além disso, a presença da alteração no interior das células impediu a infecção por HIV-1, sugerindo uma possível abordagem também profilática pela imunização das células alvo contra o HIV-1 com elevada especificidade e eficiência. ^(55,56)

 

Para garantir mais alta eficácia de edição, deve se considerar a região mais estável do genoma do HIV-1 como alvo. A extrema baixa homologia entre o genoma viral e o genoma celular hospedeiro foi apontado como um marco de segurança para futuros tratamentos.⁽⁵⁵⁾ Este conceito pode ser aplicado para outros tipos de células, incluindo células T-linfóides, os astrócitos e as células estaminais neurais.^(36,57)

 

A microglia, tipo de células positivas para CD4, têm sido mostrados como sendo altamente susceptíveis à infecção por HIV com tropismo de macrófagos ^(58,59). A microglia expressa os receptores de quimiocina-¯, CCR5 e CCR3. Schweighardt e Atwood concluíram em pesquisa que a infecção pelo HIV de células microgliais pode ser inibida por pré-tratamento com os ligandos destes dois co-receptores CCR5 e CCR3 desempenhar um papel na infecção pelo HIV in vivo da microglia ⁽¹⁷⁾

 

Agrawal et al. compararam os papéis de CCR3 e CCR5 no sistema nervoso central e na infecção por HIV-1 e a utilidade potencial de CCR3 como um alvo para a manipulação através de transferência de genes. Para atingir o CCR3, foi desenvolvido um anticorpo levado por vetores à células microgliais do cérebro e macrófagos derivados de monócitos de forma altamente eficiente. Do mesmo modo, foi desenvolvido um anticorpo para atingir CCR5, que agiram de forma independente. As células estudadas mostraram a presença de  CCR3 e CCR5 co-localizados na membrana plasmática juntamente com o receptor CD4. Nos resultados descreveram que para algumas espécies de HIV-1, é necessário tanto co-receptor CCR3 quanto o CCR5 para a infecção da microglia e macrófagos. Algumas cepas de HIV-1 foram relativamente puramente CCR5-trópico. Nenhum se mostrou puramente CCR3-trópico. Foram comparados os efeitos de regulação negativa do CCR3 e CCR5. Estes dados sugerem que para alguns tipos de HIV-1, isolados a partir de sistema nervoso central ou sangue periférico, CCR3 pode ser utilizado em conjunto com o CCR5 na entrada de VIH-1 em macrófagos e micróglia do cérebro.⁽⁶⁰⁾

A observação de que alguns subtipos de VIH-1 utilizam mais de um co-receptor levantou a questão de saber se situação semelhante ocorre para o HIV-1 infectar fagócitos fora do SNC. Então, os mesmos autores testaram a inibição da replicação do HIV-1 em macrófagos modificados por anti-CCR3 e anti-CCR5. Resultados semelhantes foram obtidos quando as culturas foram tratadas com qualquer um dos anticorpos. Houve redução significativa da replicação do HIV-1 nos macrófagos estudados.⁽⁶⁰⁾

 

As estratégias terapêuticas destinadas tanto CCR3 e CCR5 podem, ser útil na inibição de infecção por HIV-1. Sabe-se, entretanto, que o CCR3 é utilizado de forma eficiente por espécies HIV-1 em Macrófagos.

 

Muitas são as opções testadas na busca da tão sonhada cura da AIDS. A edição genética in vitro de células autólogas, modificando a expressão dos receptores CCR5, seguida de devolução destas ao paciente parece ser a ideia mais difundida. Isto minimizaria os riscos de reação e necessidade de outros fármacos para minimizar rejeição. Estudos clínicos em humanos estão dando seus primeiros passos e demonstram-se promissores na busca do impedimento de infecção das células humanas pelo HIV-1. Apesar disto, o risco de genotoxicidade é importante.

 

Ao que parece, a cura da AIDS está cada vez mais perto. Entretanto, apesar dos inúmeros esforços, todas as pesquisas até agora esbarram em dificuldades e avançam somente até certo ponto. Estratégias baseadas em terapias genéticas se mostram uma base promissora para a busca do controle e erradicação da epidemia mundial do vírus HIV.  Contudo, a eficiência da edição genética ainda é um passo a ser atingido. Como sugerem as pesquisas, o desenvolvimento de vetores mais eficientes para chegada do sistema terapêutico ao alvo se faz necessário. Neste sentido, estudos com o uso de adenovírus já foram iniciados.⁽¹⁰⁾

 

Desafios como o controle de alterações permanentes no genoma celular, efeitos da terapia fora dos alvos celulares, mutações indesejáveis, citotoxicidade, escape viral, custos, etc, provocam a ciência e têm sido aos poucos sanados. O HIV está na mira dos cientistas e muito provavelmente estes irão ganhar a guerra.

 

Juliana Vieira Bitante Freitas-odontóloga

Otávio Rodrigues Filho-Medicina -UFGD-XIVa turma